本發(fā)明涉及植物培育，尤其涉及一種羅漢果子房愈傷組織誘導(dǎo)的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、羅漢果(siraitia?grosvenorii)是葫蘆科羅漢果屬多年生藤本植物，我國(guó)85％左右的羅漢果產(chǎn)自廣西桂林市，主要分布在永?？h、臨桂區(qū)、龍勝縣等地區(qū)。羅漢果每年夏秋季節(jié)開(kāi)花結(jié)果，果實(shí)富含羅漢果甜苷、果糖、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用藥材，具有抗菌消炎、止咳潤(rùn)肺、涼血滑腸等功效，在臨床上用于治療肺結(jié)核、哮喘、胃炎、急慢性氣管炎等疾病。此外，羅漢果甜苷v為世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一，甜度可達(dá)蔗糖甜度的300～400倍，同時(shí)其熱量極低，還有降血糖等功效，因此成為了高血糖、高血壓、高血脂和肥胖癥患者的首選糖替代品，已廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品中，也是我國(guó)年出口增長(zhǎng)最快的植物提取物之一。
2、羅漢果傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)主要有種子繁殖、壓蔓繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖。種子繁殖就是利用羅漢果的種子進(jìn)行繁殖，屬于有性繁殖，此方法操作簡(jiǎn)單，繁殖系數(shù)高，繁殖的成苗適應(yīng)性強(qiáng)，但是繁殖周期長(zhǎng)，所以難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，并且由于羅漢果雌雄異株且雄花和雌花的花期不同，自然條件下難以順利結(jié)果，所以實(shí)際生產(chǎn)中，羅漢果的繁殖多以無(wú)性繁殖為主。壓蔓繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖等常用的無(wú)性繁殖方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，但長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖容易造成病蟲(chóng)害嚴(yán)重、種性退化等問(wèn)題。
3、羅漢果傳統(tǒng)的育種通常依賴于雜交和篩選，這一過(guò)程往往需要多個(gè)世代才能獲得純合體植株。植物組織培養(yǎng)是一種成熟的植物育種和高效擴(kuò)繁技術(shù)，要解決長(zhǎng)期無(wú)性繁殖造成的品種退化等問(wèn)題，其重要方法之一就是將植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到羅漢果的脫毒培育中，于是羅漢果的組織培養(yǎng)應(yīng)運(yùn)而生。羅漢果的組織培養(yǎng)技術(shù)就是把離體的羅漢果組織、器官或者細(xì)胞放在無(wú)菌、無(wú)毒、營(yíng)養(yǎng)充足的培養(yǎng)基上，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境下，通過(guò)激素調(diào)控使其脫分化產(chǎn)生愈傷組織，然后進(jìn)一步誘導(dǎo)愈傷組織再分化最終發(fā)育為羅漢果幼苗的過(guò)程。其中，單倍體育種是一種利用離體培養(yǎng)的方法，將僅含母體一半染色體的植物器官、組織或細(xì)胞培育成單倍體植株，再通過(guò)染色體加倍技術(shù)，使這些單倍體的染色體加倍，從而獲得與母體染色體組數(shù)目相同的植株的育種技術(shù)，該育種技術(shù)可以顯著縮短育種年限，獲得所需性狀的純合體，提高育種效率。
4、然而，目前為止尚未有羅漢果未授粉子房離體培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本發(fā)明的主要目的是提供一種羅漢果未授粉子房愈傷組織誘導(dǎo)方法，本發(fā)明通過(guò)探究不同因素對(duì)羅漢果未授粉子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選出適宜的愈傷組織誘導(dǎo)條件，為實(shí)現(xiàn)羅漢果未授粉子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)再生單倍體植株提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)，為進(jìn)一步構(gòu)建羅漢果單倍體育種體系奠定了基礎(chǔ)。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
3、一種羅漢果未授粉子房愈傷組織誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：
4、(1)材料采集：取新鮮未授粉、無(wú)病蟲(chóng)害羅漢果子房；
5、(2)消毒：將羅漢果未授粉子房除去花冠、花萼和花柱，只留下子房，清水洗凈，消毒液消毒；
6、(3)切割：取消毒后的子房切片；
7、(4)培養(yǎng)：取子房切片在26～35℃、黑暗環(huán)境下預(yù)處理3～5天后接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
8、進(jìn)一步地，步驟(1)中，羅漢果子房為開(kāi)花前一天的子房，采摘時(shí)間為早晨9:00-10:00，摘取后，放入冰盒低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
9、進(jìn)一步地，步驟(2)中，消毒液為75％乙醇和1.5％次氯酸鈉，所述消毒具體步驟為：將子房先削皮再用75％乙醇消毒20～40s，無(wú)菌水沖洗3次，然后用1.5％次氯酸鈉溶液消毒5～15min，期間不斷振蕩，最后用無(wú)菌水沖洗5次。
10、進(jìn)一步地，步驟(3)中，子房的切片方式為橫切或縱切，切片后的子房厚度為1.5～3mm。
11、進(jìn)一步地，步驟(4)中，預(yù)處理溫度為30℃，時(shí)間為4天；培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，溫度為26℃，光照周期為12～16h/d,光照強(qiáng)度為2000～3000lx。
12、進(jìn)一步地，步驟(4)中，培養(yǎng)基為添加有20～40g/l蔗糖、4～8g/l瓊脂、0.03～0.09mg/ltdz和0.1～0.4mg/lnaa的ms培養(yǎng)基，ph值5.8～6.0。
13、進(jìn)一步地，步驟(4)中，所述培養(yǎng)基中，tdz濃度為0.06mg/l，naa濃度為0.25mg/l。
14、本發(fā)明有益效果至少包括：
15、本發(fā)明通過(guò)探究不同因素對(duì)羅漢果未授粉子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選出適宜的愈傷組織誘導(dǎo)條件，使用75％乙醇(30s)、1.5％次氯酸鈉(10min)消毒削皮的子房效果最好，正常子房占比高達(dá)72.00％；0.06mg/ltdz和0.25mg/lnaa的激素配比對(duì)子房的愈傷組織誘導(dǎo)效果最高，誘導(dǎo)率為50.0％，愈傷組織呈淺黃色、結(jié)構(gòu)松散；處于開(kāi)花前一天的子房的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為45.0％；橫切處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率為27.0％，縱切處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率為24.0％，總體上差別不大；在30℃下黑暗處理4d的子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為35.7％，即本發(fā)明初步建立了羅漢果未授粉子房誘導(dǎo)愈傷組織的體系，為后續(xù)建立羅漢果雌核離體培養(yǎng)乃至單倍體育種體系打下了基礎(chǔ)。
1.一種羅漢果未授粉子房愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，羅漢果子房為開(kāi)花前一天的子房，采摘時(shí)間為早晨9:00-10:00，摘取后，放入冰盒低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，消毒液為75％乙醇和1.5％次氯酸鈉，所述消毒具體步驟為：將子房先削皮再用75％乙醇消毒20～40s，無(wú)菌水沖洗3次，然后用1.5％次氯酸鈉溶液消毒5～15min，期間不斷振蕩，最后用無(wú)菌水沖洗5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，子房的切片方式為橫切或縱切，切片后的子房厚度為1.5～3mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，預(yù)處理溫度為30℃，時(shí)間為4天；培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，溫度為26℃，光照周期為12～16h/d,光照強(qiáng)度為2000～3000lx。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，培養(yǎng)基為添加有20～40g/l蔗糖、4～8g/l瓊脂、0.03～0.09mg/ltdz和0.1～0.4mg/lnaa的ms培養(yǎng)基，ph值5.8～6.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述培養(yǎng)基中，tdz濃度為0.06mg/l，naa濃度為0.25mg/l。
8.權(quán)利要求1～7任一所述方法在羅漢果子房愈傷組織誘導(dǎo)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1～7任一所述方法在羅漢果單倍體育種中的應(yīng)用。