本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、糖尿病足潰瘍是糖尿病最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致患者截肢甚至死亡的主要原因。目前，針對(duì)糖尿病足潰瘍的治療方法包括清創(chuàng)、抗感染、血管重建及創(chuàng)面修復(fù)等，但傳統(tǒng)治療手段效果有限，尤其對(duì)于難愈性潰瘍，臨床需求尚未得到充分滿足。
2、近年來，基于間充質(zhì)干細(xì)胞（mscs）的新型療法成為研究熱點(diǎn)，尤其是臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，因其可獲取性強(qiáng)、增殖能力高、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。干細(xì)胞治療糖尿病足潰瘍的作用機(jī)制主要包括：
3、（1）促進(jìn)血管新生：干細(xì)胞通過分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vegf）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bfgf）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（ngf）等細(xì)胞因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管重塑，改善局部微循環(huán)；（2）免疫調(diào)節(jié)：干細(xì)胞通過抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，包括il-6、tnf-α等，同時(shí)促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子il-10、il-12的分泌，減輕炎癥微環(huán)境，加速創(chuàng)面愈合。
4、然而，現(xiàn)有干細(xì)胞治療技術(shù)仍存在以下局限性：（1）干細(xì)胞在不同的培養(yǎng)體系中增殖能力和活力有區(qū)別，使用未經(jīng)優(yōu)化的常規(guī)培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)干細(xì)胞，其增殖能力和細(xì)胞活力劣于優(yōu)化后的培養(yǎng)體系，且該劣勢(shì)會(huì)影響干細(xì)胞在體內(nèi)的活性；（2）干細(xì)胞治療傷口的核心機(jī)制是通過分泌多種生物活性因子（如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子vegf-c等），間接促進(jìn)血管生成、上皮細(xì)胞增殖及膠原沉積。但未經(jīng)優(yōu)化的干細(xì)胞旁分泌能力有限，難以滿足傷口修復(fù)需求；（3）現(xiàn)有采用添加因子等手段進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)體系優(yōu)化的方式成本高昂，抬高了干細(xì)胞藥物的售價(jià)，限制了干細(xì)胞制劑的臨床推廣。
5、因此，亟需開發(fā)一種能夠提高干細(xì)胞在糖尿病足潰瘍部位的旁分泌能力、增強(qiáng)干細(xì)胞的活力與功能活性的新型技術(shù)手段，且可以降低其制造成本，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，為提高間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病足潰瘍處的存活率，本方案提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基添加劑，在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中按照比例添加木犀草素和黃芩苷，可以培養(yǎng)出修復(fù)作用更強(qiáng)更高的mscs。
2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
3、一種具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中添加木犀草素和黃芩苷作為培養(yǎng)基添加劑。
4、優(yōu)選的，所述血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中，木犀草素的濃度為1-10?μmol/l，黃芩苷的濃度為1-10?μmol/l。
5、優(yōu)選的，包括如下步驟：
6、步驟一、提供臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞；
7、步驟二、在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中添加木犀草素和黃芩苷作為培養(yǎng)基添加劑；
8、步驟三、將所述間充質(zhì)干細(xì)胞接種于含添加劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
9、步驟四、收獲培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞，得到具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞。
10、進(jìn)一步優(yōu)選的，包括如下步驟：
11、步驟一、提供臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞；
12、步驟二、在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中添加木犀草素和黃芩苷作為培養(yǎng)基添加劑，其中木犀草素的濃度為1-10?μmol/l，黃芩苷的濃度為1-10?μmol/l；
13、步驟三、將所述間充質(zhì)干細(xì)胞接種于含添加劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為34-40℃、4-6%?co2，培養(yǎng)時(shí)間為48-96?h；
14、步驟四、收獲培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞，得到具有促進(jìn)傷口愈合作用的干細(xì)胞。
15、優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶華通氏膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面標(biāo)志物cd90、cd29、cd166、cd105和cd73呈陽(yáng)性表達(dá)，且cd45、cd34、cd11b、cd19和hla-dr呈陰性表達(dá)。
16、優(yōu)選的，所述血清補(bǔ)充培養(yǎng)基為α-mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加體積分?jǐn)?shù)為5%-25%的fbs。
17、優(yōu)選的，所述步驟四中的間充質(zhì)干細(xì)胞為傳代p4-p8的干細(xì)胞。
18、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的因子包括vegf-c和pge2。
19、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞通過激活vegfr3-can-nfat、ep3-pi3k/akt、akt-enos信號(hào)通路促進(jìn)血管和淋巴管生成。
20、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基添加劑還包括異丹葉大黃素。所述血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中異丹葉大黃素的濃度為0.1-10?μmol/l；進(jìn)一步的，所述血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中異丹葉大黃素的濃度為0.5-5?μmol/l。
21、優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療糖尿病足潰瘍。
22、所述方法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備用于治療糖尿病足潰瘍的藥物中的應(yīng)用。
23、本發(fā)明的有益效果：
24、1、本發(fā)明提供一種具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，在干細(xì)胞培養(yǎng)過程添加黃芩苷和木犀草素后能夠?yàn)楦杉?xì)胞的生長(zhǎng)和功能維持提供有利的微環(huán)境，能夠提高干細(xì)胞的多種生長(zhǎng)因子分泌水平。細(xì)胞的pge2的分泌情況表達(dá)明顯升高，黃芩苷組同樣有所上升，但是木犀草素和黃芩苷同時(shí)添加，pge2的分泌情況上升最明顯，pge2的分泌量達(dá)到基礎(chǔ)組的2.13倍。黃芩苷的添加可以提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的vegf-c的分泌水平，同樣的木犀草素和黃芩苷同時(shí)添加時(shí)，vegf-c的分泌水平提高最明顯，vegf-c的分泌量達(dá)到基礎(chǔ)組的1.88倍，這種協(xié)同效應(yīng)源于木犀草素通過ep3-pi3k/akt通路增強(qiáng)抗炎與血管新生作用，而黃芩苷通過vegfr3-can-nfat通路特異性促進(jìn)淋巴管生成，二者互補(bǔ)形成雙重調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
25、2、本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該培養(yǎng)方法使干細(xì)胞治療組的創(chuàng)面愈合率提升至96%，且愈合質(zhì)量顯著改善，結(jié)果表明本發(fā)明制備的干細(xì)胞能夠有效緩解慢性炎癥、促進(jìn)創(chuàng)面?zhèn)谟?；同時(shí)減少氧化應(yīng)激和纖維化，延長(zhǎng)干細(xì)胞存活時(shí)間并改善組織修復(fù)質(zhì)量。
26、3、本發(fā)明采用的木犀草素和黃芩苷均為天然來源化合物，安全性高且易于規(guī)模化制備。相較于現(xiàn)有技術(shù)中vegf、bfgf等昂貴的生長(zhǎng)因子，顯著降低生產(chǎn)成本。僅需單次注射培養(yǎng)的干細(xì)胞即可在15天內(nèi)實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面96%以上的愈合率，為糖尿病足潰瘍的標(biāo)準(zhǔn)化治療提供了高效、經(jīng)濟(jì)的解決方案。
1.一種具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中添加木犀草素和黃芩苷作為培養(yǎng)基添加劑。
2.如權(quán)利要求1所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中，木犀草素的濃度為1-10?μmol/l，黃芩苷的濃度為1-10?μmol/l。
3.如權(quán)利要求2所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：
4.如權(quán)利要求3所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：
5.如權(quán)利要求3或4所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶華通氏膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面標(biāo)志物cd90、cd29、cd166、cd105和cd73呈陽(yáng)性表達(dá)，且cd45、cd34、cd11b、cd19和hla-dr呈陰性表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述血清補(bǔ)充培養(yǎng)基為α-mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加體積分?jǐn)?shù)為5%-25%的fbs。
7.如權(quán)利要求3或4所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟四中的間充質(zhì)干細(xì)胞為傳代p4-p8的干細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求3或4所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的因子包括vegf-c和pge2。
9.如權(quán)利要求8所述的具有促進(jìn)傷口愈合的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞通過激活vegfr3-can-nfat、ep3-pi3k/akt、akt-enos信號(hào)通路促進(jìn)血管和淋巴管生成。
10.一種如權(quán)利要求9所述方法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備用于治療糖尿病足潰瘍的藥物中的應(yīng)用。