本公開涉及突變il-2多肽，以及這些多肽與半衰期延長蛋白(諸如fc單體或fc二聚體)、血清白蛋白多肽和/或特異性結(jié)合生物分子(諸如vhh多肽)和抗體的融合物，包含這些多肽的藥物組合物，以及這些組合物例如在治療癌癥或自身免疫性疾病中作為治療劑的用途。序列表參考序列表的正式副本經(jīng)由uspto專利中心作為wipo標準st.26格式的xml文件與本說明書同時提交，文件名為“17195-001pv1.xm?l，”創(chuàng)建日期為2022年11月30日，大小為163,978字節(jié)。經(jīng)由usp?to專利中心提交的該序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用方式并入本文。

背景技術(shù)：

1、白介素-2(il-2)，也稱為t細胞生長因子(tcgf)，是主要由活化的t細胞，特別是cd4+t輔助細胞產(chǎn)生的多能細胞因子。il-2信號傳導通過與三種不同的受體蛋白結(jié)合來介導：il-2rα(cd25)、il-2rβ(cd122)和il-2rγ(cd132)。免疫細胞表達il-2受體蛋白的二聚體或三聚體復合物。二聚體受體(il-2rβγ)在細胞毒性cd8+t細胞和自然殺傷細胞(nk)上表達，而三聚體受體(il-2rαβγ)主要在活化的淋巴細胞和cd4+cd25+foxp3+抑制性調(diào)節(jié)性t細胞(treg)上表達。treg細胞表達高水平的il-2rα(cd25)，并且treg增殖由il-2刺激。然而，靜息狀態(tài)的效應t細胞和nk細胞在細胞表面上不具有cd25，并且對il-2相對不敏感。

2、il-2與三種不同受體蛋白的結(jié)合顯著不同。il-2對三聚體受體具有高親和力，kd為約10pm，對二聚體受體具有中等親和力，kd為約1nm，并且對單體il-2rα受體具有低親和力，kd為約10nm。由不同受體復合物介導的il-2信號傳導活性也顯著不同。通常，已發(fā)現(xiàn)il-2rβ和il-2rγ對于il-2信號傳導很關(guān)鍵，而il-2rα(cd25)不是必需的。

3、il-2與不同細胞上表達的il-2受體蛋白的結(jié)合介導不同的免疫應答。il-2可刺激免疫應答，諸如：t細胞增殖和分化，細胞毒性t淋巴細胞(ctl)產(chǎn)生，b細胞增殖和分化，免疫球蛋白合成，以及自然殺傷(nk)細胞的產(chǎn)生、增殖和活化。il-2已被批準作為免疫治療劑用于治療癌癥和慢性病毒感染。然而，il-2還可促進免疫抑制性cd4+cd25+treg細胞的活化和增殖，從而導致免疫抑制(fontenot等人，nature?immunol.6,1142-51(2005)；d'cruz和klein，nature?immunol.6,1152-59(2005)；maloy和powrie，nature?immunol.6,1171-72(2005))。此外，il-2治療與患者的血管滲漏綜合征(vls)和肺水腫相關(guān)。據(jù)信肺水腫是由于il-2與肺內(nèi)皮細胞上的三聚體受體(il-2rαβγ)的直接結(jié)合而導致的(krieg等人，procnat?acad?sci?usa?107,11906-11(2010))。

4、已提出具有突變的il-2的工程化，以通過改變il-2對不同il-2受體亞基的選擇性或偏好來減少這些毒性副作用，從而改善其治療效果。例如，已提出使il-2靶向表達il-2rβ但不表達il-2rα的細胞可以誘導il-2rβ高的細胞群體的擴增，這改善了il-2療法的治療效果(boyman等人，science?311,1924-1927(2006))。美國專利公布2018/0142037a1描述了在il-2氨基酸位置42、45和72處引入突變，也是為了降低il-2對il-2rα受體的親和力。另一種突變il-2稱為“i?l-2h9，”其包含五個突變l80f、r81d、l85v、i86v和i92f，表現(xiàn)出與il-2rβ的結(jié)合增強，導致刺激cd25-細胞(參見levin等人，natu?re，第484卷，第529-533頁，doi：10.1038/nature10975)。突變il-2蛋白“il-23x”具有三個突變r38d、k43e和e61r，其導致對il-2rα的結(jié)合親和力非常低(參見rodrigo?vazquez-lombardi等人，naturecommunications,8:15373，doi：10.1038/ncomms15373)。然而il-23x對cd25+細胞的活化偏好仍然存在，并且突變多肽的表達水平較低，不利于后續(xù)大規(guī)模藥物生產(chǎn)。

5、因此，仍然需要il-2的變體形式，其表現(xiàn)出用于治療用途的改善的功能特性，諸如在用于治療疾病(諸如感染、癌癥和自身免疫性病癥)的藥物組合物中。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本公開整體涉及細胞因子il-2的突變體、藥物組合物以及這些組合物作為治療劑的用途，例如在治療癌癥中的用途。本
技術(shù)實現(xiàn)要素：
旨在介紹本公開的主題，但不涵蓋在本公開內(nèi)設想和描述的每一個實施方案、組合或變型。通過具體實施方式、附圖和權(quán)利要求書的公開內(nèi)容設想和描述了另外的實施方案。

2、在至少一個實施方案中，本公開提供了一種特異性結(jié)合il-2受體蛋白的突變il-2多肽，其中多肽包含與seq?id?no:10(野生型il-2)具有至少90％同一性并且相對于seq?idno:10具有選自以下的一個或多個氨基酸差異的氨基酸序列：

3、

4、

5、在至少一個實施方案中，多肽相對于seq?id?no:10還包含選自以下的一個或多個氨基酸差異：k35n、f42a、y45r、n88d、d109n和q126t。

6、在本公開的突變il-2多肽的至少一個實施方案中，多肽相對于seq?id?no:10包含選自以下的氨基酸差異的組合：

7、

8、

9、在本公開的突變il-2多肽的至少一個實施方案中，多肽包含選自以下的氨基酸差異的組合：

10、

11、

12、在本公開的突變il-2多肽的至少一個實施方案中，多肽包含選自以下的氨基酸序列：seq?id?no:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144和145。

13、在本公開的突變il-2多肽的至少一個實施方案中，相對于seq?id?no:10的c125sil-2多肽，多肽的特征在于以下特性中的一種或多種：

14、(i)當在哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達時滴度增加；

15、(ii)溶解度增加；

16、(iii)對il-2rα受體的結(jié)合親和力降低；和/或

17、(iv)對il-2rβ和il-2rγ受體的結(jié)合親和力降低。

18、在本公開的突變il-2多肽的至少一個實施方案中，多肽通過接頭與單體或二聚體fc多肽融合；任選地，其中fc多肽是包含seq?id?no:146、147或148的氨基酸序列的單體fc多肽。在至少一個實施方案中，接頭由長度為至少1-50個氨基酸的多肽組成。在至少一個實施方案中，接頭包含具有選自(ggggs)1(seq?id?no:149)、(ggggs)2(seq?id?no:150)、(ggggs)3(seq?id?no:151)、(ggggs)4(seq?id?no:152)、(grpgs)2(seq?id?no:153)、(grpgs)4(seq?id?no:154)和(ggggs)3ggg(seq?id?no:155)的氨基酸序列的多肽。在至少一個實施方案中，接頭綴合至fc多肽的c端和突變il-2多肽的n端。在至少一個實施方案中，接頭綴合至fc多肽的n端和突變il-2多肽的c端。

19、在至少一個實施方案中，本公開提供了一種多核苷酸，該多核苷酸編碼本公開的突變il-2多肽。在至少一個實施方案中，本公開提供了一種表達載體，該表達載體包含編碼本公開的突變il-2多肽的多核苷酸。

20、在至少一個實施方案中，本公開還提供了一種分離的宿主細胞，該分離的宿主細胞包含編碼本公開的突變il-2多肽的多核苷酸或包含這種多核苷酸的表達載體。在至少一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞；任選地，哺乳動物細胞選自中國倉鼠卵巢(cho)細胞、骨髓瘤細胞(例如y0、ns0、sp2/0)、猴腎細胞(cos-7)、人胚腎細胞系(293)、幼倉鼠腎細胞(bhk)、小鼠塞爾托利氏細胞(例如，tm4)、非洲綠猴腎細胞(vero-76)、人宮頸癌細胞(hela)、犬腎細胞、人肺細胞(w138)、人肝細胞(hep?g2)、小鼠乳腺腫瘤細胞、tr1細胞、醫(yī)學研究委員會5(mrc?5)細胞和fs4細胞。

21、在至少一個實施方案中，本公開還提供了一種用于產(chǎn)生本公開的突變il-2多肽的方法，該方法包括在適于表達本公開的突變il-2多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼該多肽的多核苷酸或表達載體的宿主細胞。

22、在至少一個實施方案中，本公開還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含本公開的突變il-2多肽以及藥學上可接受的載劑。

23、在至少一個實施方案中，本公開還提供了一種用于治療受試者的疾病(例如，il-2介導的疾病)的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的本公開的突變il-2多肽或者向受試者施用治療有效量的包含本公開的突變il-2多肽和藥學上可接受的載劑的藥物組合物。在該方法的至少一個實施方案中，疾病是癌癥；任選地，其中癌癥選自結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、食管癌和胃癌、頭頸癌、宮頸癌、前列腺癌、黑色素瘤、膀胱癌或口腔癌。

24、在治療癌癥的方法的至少一個實施方案中，相對于seq?id?no:10的c125?il-2多肽的il-2rα結(jié)合親和力，所施用的突變il-2多肽表現(xiàn)出選擇性降低的il-2rα結(jié)合親和力。在該方法的至少一個實施方案中，多肽相對于seq?id?no:10包含選自以下的氨基酸差異的組合：

25、 p65n、e67t； p65n、e67s； f42n、f44t k35n、p65n、e67t； k35n、p65n、e67s； k35n、y45r、p65n、e67s； k35n、y45r、p65n、e67t； k35n、f42n、f44t、d109n； k35n、f42n、f44s、d109n； f42a、r81n、p82a、r83t； f42a、r81n、p82a、r83s； y45r、r81n、p82a、r83t；以及 y45r、r81n、p82a、r83s。

26、在治療疾病的方法的至少一個實施方案中，疾病是自身免疫性疾??；任選地，其中自身免疫性疾病選自克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、1型糖尿病、特應性皮炎、銀屑病、多發(fā)性硬化癥。

27、在治療自身免疫性疾病的方法的至少一個實施方案中，相對于seq?id?no:10的c125?il-2多肽的il-2rβγ結(jié)合親和力，多肽表現(xiàn)出選擇性降低的il-2rβγ結(jié)合親和力。在該方法的至少一個實施方案中，多肽相對于seq?id?no:10包含選自以下的氨基酸差異的組合：

28、

29、

30、