本發(fā)明涉及一種分化鱗芽離體化學(xué)誘變與培養(yǎng)、高效獲得大蒜突變體的方法，屬于大蒜誘變育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1、大蒜(allium?sativum?l.)作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全球范圍內(nèi)具有廣泛的栽培和應(yīng)用。大蒜花沒有育性，以無性方式進(jìn)行繁殖。我國大蒜種質(zhì)資源豐富、優(yōu)良品種繁多，但由于不能進(jìn)行雜交育種，其遺傳性和生物學(xué)多樣性都未得到充分利用。大蒜無性繁殖的病毒累積弊端，導(dǎo)致地方優(yōu)良品種退化嚴(yán)重，甚至瀕臨滅絕。因此大蒜的種質(zhì)資源創(chuàng)制和新品種高效培育勢在必行。目前大蒜育種和種質(zhì)創(chuàng)制以無性常規(guī)育種為主，其中主要包括系統(tǒng)選育與誘變選育。大蒜系統(tǒng)選育以體細(xì)胞自然突變?yōu)榛A(chǔ)的選育體系，其選育時間長，效率低。大蒜誘變選育是以射線輻射、化學(xué)試劑和航天誘變?yōu)槭侄?，加速體細(xì)胞突變進(jìn)程，實現(xiàn)高突變率，從而快速獲得優(yōu)良性狀的種質(zhì)和品種，是目前大蒜育種最主要手段。
2、大蒜誘變選育中以化學(xué)誘變?yōu)橹?，誘導(dǎo)技術(shù)多采用大蒜根尖、莖尖、花苞、莖盤、成熟鱗芽和愈傷組織等材料，經(jīng)過誘變試劑處理獲得突變體。根尖、莖尖和愈傷組織作為誘變材料，誘變試劑處理后死亡率高，同時需要無菌操作與愈傷培養(yǎng)，不但存在污染率高的問題，而且培養(yǎng)時間長，存活率低，造成誘變效率極差?；ò⑶o盤和成熟鱗芽為誘變材料，由于分生組織較少，或不能充分暴露，以半致死量為標(biāo)準(zhǔn)的誘變劑量很難獲得較高且穩(wěn)定突變率，在成熟鱗芽誘變中，這一弊端尤為突出。cn113170728a公開了“一種誘導(dǎo)大蒜多倍體或突變體的方法”，該方法以暴露生長點和保存母體營養(yǎng)為著重點，可以直接大田培養(yǎng)(無需室內(nèi)培養(yǎng))，縮短周期，提高誘變效率。上述專利在實施過程中存在一些不足，如由于誘變材料體積較大，化學(xué)誘變試劑消耗大，易造成環(huán)境風(fēng)險；而蒜瓣切口處易感染真菌并腐爛，誘變處理材料存在一定的死亡率，不利于大蒜突變體庫的建立。因此，需要開發(fā)一種新的誘變大蒜突變體的方法，提高獲得突變體的效率。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種分化鱗芽離體化學(xué)誘變與培養(yǎng)、高效獲得大蒜突變體的方法。
2、技術(shù)方案：本發(fā)明所述包括如下步驟：
3、(1)早期鱗芽準(zhǔn)備：取大蒜植株，在大蒜鱗芽膨大初期，將分化鱗芽剝離，在蒸餾水中浸泡，得到分化鱗芽；
4、(2)分化鱗芽ems誘變：將分化鱗芽浸泡于ems(甲基磺酸乙酯)溶液中，低速搖蕩，過濾，放入硫代硫酸鈉溶液中浸泡，用水振蕩洗滌多次；
5、(3)洗滌后的分化鱗芽在次氯酸鈉溶液中進(jìn)行滅菌，再用無菌水沖洗多次，轉(zhuǎn)移到ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大蒜幼苗；
6、(4)對大蒜幼苗進(jìn)行外觀性狀鑒定，得到表型突變植株；
7、(5)移栽表型突變植株到培養(yǎng)缽中煉苗；
8、(6)突變植株帶土移栽到大田里，正常養(yǎng)護(hù)。
9、進(jìn)一步地，步驟(1)中，分化鱗芽剝離包括以下步驟：將大蒜植株拔出，在莖盤上2cm處切斷假莖，將莖盤上膨大部位一層一層剝離，沿莖盤將分化鱗芽剝離。分化鱗芽膨大至2mm以上且大部分外葉未閉合。外葉沒有閉合的分化鱗芽直接剝離；外葉閉合的，可切除外葉頂部保證開口，再將分化鱗芽剝離。大蒜膨大初期為每年2月中旬到3月中旬。
10、進(jìn)一步地，步驟(2)中，ems溶液的濃度為0.5-1.0％，低速振蕩的速度為50-80r/min，低速振蕩的時間為4-6小時，硫代硫酸鈉溶液濃度0.3-0.5mol/l，浸泡時間為5min以上，用水振蕩洗滌3次以上，每次3-5min。
11、進(jìn)一步地，步驟(3)中，次氯酸鈉溶液的濃度為15-20％(未稀釋的次氯酸鈉溶液有效氯濃度為6-10％)，滅菌的時間為10-15min，用無菌水沖洗3次以上；在ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化鱗芽生根發(fā)芽至2-3葉期，ms培養(yǎng)基包括：每升水含38-40g?ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基(其中，蔗糖含量2.8-3.2％)和6.5-7.5g瓊脂，培養(yǎng)的條件為：溫度23-25℃，12-14小時光照與10-12小時黑暗培養(yǎng)，濕度為40-60％；培養(yǎng)期間每月?lián)Q一次ms培養(yǎng)基。
12、進(jìn)一步地，步驟(4)中，是鑒定大蒜幼苗葉片的外觀性狀，外觀性狀包括：顏色、長度和/或?qū)挾?。鑒定表型突變植株通過與正常分化的大蒜幼苗做對比，葉片顏色明顯變化，通過與對照苗性狀表型進(jìn)行比較，ems誘變的葉片顏色明顯黃化，葉片長度、寬度的差異超過20％以上，則認(rèn)定為優(yōu)異突變鱗芽。
13、進(jìn)一步地，步驟(5)中，培養(yǎng)缽中的土壤基質(zhì)為育苗基質(zhì)，按體積比包括：進(jìn)口草炭：脫鹽椰糠：珍珠巖：蛭石為(2.5-3.5)：(1-1.2)：(1-1.2)：(0.8-1.0)，ph為5.5-7.0，有機(jī)質(zhì)>20％，土壤基質(zhì)經(jīng)100-130℃高溫滅菌15min以上；4葉期左右移栽表型突變植株到培養(yǎng)缽中煉苗，煉苗的條件包括：溫度23-25℃，12-14小時光照與10-12小時黑暗，濕度為40-60％。有害突變，可以根據(jù)苗勢，在5-6葉期葉移栽到培養(yǎng)缽中煉苗。移栽至培養(yǎng)缽中前，用殺菌劑溶液澆透土壤基質(zhì)，殺菌劑為甲基托布津或百菌清，殺菌劑用水稀釋600-800倍得到殺菌劑溶液；將表型突變植株移栽到土壤基質(zhì)中，用營養(yǎng)液澆灌，營養(yǎng)液為尿素水溶液(0.1％濃度)或1/3濃度霍格蘭德營養(yǎng)液，后面每3-4天澆灌營養(yǎng)液1次，同時澆水保證基質(zhì)濕潤。每次可以根據(jù)幼苗情況，可將營養(yǎng)液濃度逐步提高到1倍濃度霍格蘭德營養(yǎng)液或者濃度0.3％尿素。
14、進(jìn)一步地，步驟(6)中，到6葉期移栽到大田里，移栽前，需在室外煉苗3天以上。一般在南方11月上旬前完成室外移栽，在北方10月下旬前完成移栽。有害突變根據(jù)煉苗情況確定后期種植方式。如煉苗長勢變好，可以移栽到大田里，正常養(yǎng)護(hù)。如果長勢仍弱，可以移栽到大花盆中室內(nèi)培養(yǎng)成。
15、有益效果：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：(1)本發(fā)明方法外葉未閉合的分化鱗芽體積相較于現(xiàn)有技術(shù)降低2-3個數(shù)量級，使用誘變試劑ems的使用量將極大減少，降低誘變試劑成本。(2)本發(fā)明不需要配置大量ems誘變試劑操作方便，對人與自然存在潛在的危害小。(3)本發(fā)明采用的外葉未閉合的分化鱗芽，內(nèi)部儲存葉沒有膨大，芽點基本暴露，ems可以充分作用于生長點，突變率高。(4)本發(fā)明分化鱗芽ems處理后，在室內(nèi)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生存條件好，利于有害突變的生存。
1.一種分化鱗芽誘導(dǎo)大蒜突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，分化鱗芽剝離包括以下步驟：將大蒜植株拔出，在莖盤上切斷假莖，將莖盤上膨大部位一層一層剝離，沿莖盤將分化鱗芽剝離。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，分化鱗芽膨大至2mm以上且大部分外葉未閉合，外葉沒有閉合的分化鱗芽直接剝離，外葉閉合的，切除外葉頂部保證開口，再將分化鱗芽剝離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，ems溶液的濃度為0.5-1.0％，低速振蕩的速度為50-80r/min，低速振蕩的時間為4-6小時，硫代硫酸鈉溶液濃度0.3-0.5mol/l，浸泡時間為5min以上，用水振蕩洗滌3次以上，每次3-5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，次氯酸鈉溶液的濃度為15-20％，滅菌的時間為10-15min，用無菌水沖洗3次以上；在ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化鱗芽生根發(fā)芽至2-3葉期，ms培養(yǎng)基包括：每升水含38-40g?ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基和6.5-7.5g瓊脂，培養(yǎng)的條件為：溫度23-25℃，12-14小時光照與10-12小時黑暗培養(yǎng)，濕度為40-60％；培養(yǎng)期間每月?lián)Q一次ms培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，鑒定表型突變植株時是鑒定大蒜幼苗葉片的外觀性狀，外觀性狀包括：顏色、長度和/或?qū)挾取?/p>
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，培養(yǎng)缽中的土壤基質(zhì)為育苗基質(zhì)，按體積比包括：進(jìn)口草炭：脫鹽椰糠：珍珠巖：蛭石為(2.5-3.5)：(1-1.2)：(1-1.2)：(0.8-1.0)，ph為5.5-7.0，有機(jī)質(zhì)>20％，土壤基質(zhì)經(jīng)100-130℃高溫滅菌15min以上；煉苗的條件包括：溫度23-25℃，12-14小時光照與10-12小時黑暗，濕度為40-60％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，移栽至培養(yǎng)缽中前，用殺菌劑溶液澆透土壤基質(zhì)，殺菌劑為甲基托布津或百菌清，殺菌劑用水稀釋600-800倍得到殺菌劑溶液；將表型突變植株移栽到土壤基質(zhì)中，用營養(yǎng)液澆灌，營養(yǎng)液為尿素水溶液或霍格蘭德營養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，每3-4天澆灌營養(yǎng)液1次，同時澆水保證基質(zhì)濕潤。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)中，到6葉期進(jìn)行移栽，移栽前，需在室外煉苗3天以上。