發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及與肺癌相關(guān)的生物標(biāo)志物以及使用該生物標(biāo)志物來(lái)確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法。發(fā)明背景根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)告的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，在2020年占所有癌癥死亡的18％(ferlay等人，2020)。高死亡率可歸因于晚期癌癥的檢測(cè)，因?yàn)樵谠缙?i期或ii期)診斷的肺癌患者的五年存活率大約為70％，但當(dāng)在晚期(iii期和iv期)診斷出癌癥時(shí)，五年存活率降至20％或更低。胸部x射線和痰涂片是最常見(jiàn)的肺癌篩查技術(shù)，但此類測(cè)試的靈敏度低，因此在早期診斷癌癥方面的效用有限。如果需要，可以使用光纖支氣管鏡檢查或活組織檢查來(lái)直接檢查病變并確定病理的性質(zhì)，但是此類方法是侵入性的，并且難以應(yīng)用于更大規(guī)模的高危人群測(cè)試。低劑量螺旋ct目前被認(rèn)為是最有效的肺癌篩查技術(shù)，其是無(wú)創(chuàng)、高靈敏度的，但假陽(yáng)性率高達(dá)96.4％，篩查成本相對(duì)較高。因此，對(duì)于篩查群體以提高肺癌的早期診斷和治療的比率從而降低肺癌死亡率的有效方法存在未滿足的需求。需要提供診斷肺癌的替代方法。發(fā)明概述一方面，本公開(kāi)涉及確定受試者是否患有肺癌或是否有發(fā)展肺癌的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述方法包括檢測(cè)/測(cè)定來(lái)自獲自受試者的生物樣品的至少一種mirna的表達(dá)水平，其中所述至少一種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。在某些實(shí)施方案中，該方法包括檢測(cè)至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少十一種或至少十二種mirna。在某些實(shí)施方案中，用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)/測(cè)定生物樣品中hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，將選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的至少一種mirna的表達(dá)水平與對(duì)照中所述一種或多種mirna的表達(dá)進(jìn)行比較，其中與對(duì)照相比，獲自受試者的生物樣品中所述一種或多種mirna的差異表達(dá)水平指示受試者患有肺癌或有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。在某些實(shí)施方案中，用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括：a.獲得受試者的生物樣品；b.將所述生物樣品與適于檢測(cè)一種或多種mirna的分離的探針組接觸，所述一種或多種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。c.將生物樣品中所述一種或多種mirna的表達(dá)水平與對(duì)照中相同mirna的水平進(jìn)行比較；d.通過(guò)所述一種或多種mirna與對(duì)照相比的差異表達(dá)來(lái)確定所述受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。在某些實(shí)施方案中，獲自受試者的生物樣品是非細(xì)胞生物流體。在某些實(shí)施方案中，所述非細(xì)胞生物流體是血漿或血清。在某些實(shí)施方案中，該方法還包括檢測(cè)至少一種附加的生物標(biāo)志物的存在。在某些實(shí)施方案中，該方法還包括檢測(cè)來(lái)自獲自受試者的生物樣品的至少一種另外的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，所述附加的生物標(biāo)志物是選自癌胚抗原(cea)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)、癌抗原125(ca-125)或細(xì)胞角蛋白19片段抗原(cyfra?21-1)中的一種或多種。在一些其它實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物是cea。在某些實(shí)施方案中，用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法還包括附加的臨床試驗(yàn)。在一些實(shí)施方案中，所述附加的臨床試驗(yàn)包括一個(gè)或多個(gè)成像測(cè)試、痰細(xì)胞學(xué)、活組織檢查或其組合。在某些實(shí)施方案中，成像測(cè)試包括ct掃描、x射線、mri或pet掃描。還提供了治療被鑒定為患有肺癌的受試者的方法，其包括：a.通過(guò)檢測(cè)來(lái)自獲自受試者的生物樣品的至少一種mirna的表達(dá)水平來(lái)確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，其中所述至少一種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。b.將生物樣品中所述一種或多種mirna的表達(dá)水平與對(duì)照中的表達(dá)水平進(jìn)行比較；c.用一種或多種適于治療肺癌的治療方法治療被確定為患有肺癌或被確定為有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者。在一些實(shí)施方案中，適于治療肺癌的所述一種或多種治療方法包括施用抗癌化合物、手術(shù)和/或放射療法。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照可以包括獲自健康受試者、非患病受試者、無(wú)癌癥受試者、無(wú)肺癌受試者和/或未患肺癌或沒(méi)有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的一種或多種生物樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照可包括在獲自所述受試者的所述一種或多種生物樣品中測(cè)量的所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平用于確定受試者是否患有肺癌或是否有肺癌風(fēng)險(xiǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種mirna可通過(guò)一種或多種方法檢測(cè)，所述方法是諸如但不限于測(cè)序、核酸雜交、微陣列核酸擴(kuò)增等。還提供了用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括能夠檢測(cè)一種或多種mirna的分離的探針組，所述一種或多種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括能夠檢測(cè)hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的分離的探針組。在一些實(shí)施方案中，所述探針選自適體、抗體、親和體(affibody)、肽和核酸。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含適合于確定選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的至少一種mirna的表達(dá)水平的分離的探針組，所述至少一種mirna可通過(guò)一種或多種方法檢測(cè)，所述方法是諸如但不限于測(cè)序、核酸雜交、微陣列和核酸擴(kuò)增等。在一些實(shí)例中，核酸擴(kuò)增可包括、但不限于定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qpcr)、鎖核酸pcr、基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)的測(cè)定或等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包括用于檢測(cè)至少一種附加的生物標(biāo)志物的探針和/或試劑。在一些實(shí)施方案中，所述附加的生物標(biāo)志物是選自癌胚抗原(cea)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)、癌抗原125(ca-125)或細(xì)胞角蛋白19片段抗原(cyfra?21-1)中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述附加的生物標(biāo)志物是cea。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及適于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物組合，其中所述組合包括選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種生物標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組合包括hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物組合還包括cea。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物組合適用于檢測(cè)獲自受試者的生物樣品中的生物標(biāo)志物，其中所述生物樣品是非細(xì)胞生物流體，諸如血漿和/或血清樣品。在另一方面，本發(fā)明還涉及適于檢測(cè)一種或多種生物標(biāo)志物的至少一種試劑在制造或制備診斷劑/試劑盒中的用途，所述診斷劑/試劑盒用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的任何上述方法中。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種試劑用于測(cè)量/測(cè)定獲自受試者的生物樣品中選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p中的至少一種、二種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，所述試劑用于測(cè)量/測(cè)定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物包括hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。在一些實(shí)施例中，所述試劑用于測(cè)量/測(cè)定至少一種附加的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，所述附加的生物標(biāo)志物是選自癌胚抗原(cea)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)、癌抗原125(ca-125)或細(xì)胞角蛋白19片段抗原(cyfra21-1)中的一種或多種。定義如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“mirna”指微小rna，小的非編碼rna分子，其在一些實(shí)例中包含約19至25個(gè)核苷酸，并存在于植物、動(dòng)物和一些病毒中。已知mirna在rna沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用。這些高度保守的rna通過(guò)與特定mrna的3’-非翻譯區(qū)(3’-utr)結(jié)合來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。例如，每個(gè)mirna被認(rèn)為調(diào)控多個(gè)基因，由于預(yù)計(jì)在高等真核生物中存在數(shù)百個(gè)mirna基因，因此mirna往往從基因組中的幾個(gè)不同基因座轉(zhuǎn)錄。這些基因編碼具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)rna，當(dāng)被一系列rna酶iii(包括drosha和dicer)加工時(shí)，其形成通常約19-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的mirna雙鏈體，在3’末端有2nt的突出。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，mirna是一種類型的多核苷酸，其具有包含字母諸如“augc”的序列。應(yīng)當(dāng)理解，核苷酸從左至右按5’>3’順序排列，除非另有說(shuō)明，否則“a”表示腺苷，“u”表示尿嘧啶，“g”表示鳥(niǎo)苷，“c”表示胞嘧啶。字母a、u、g和c可以用來(lái)指代堿基本身。如本文中所用，“肺癌”(在某些情況下縮寫(xiě)為“l(fā)c”)是指在肺組織中形成惡性(癌)細(xì)胞的疾病。肺癌的主要亞型是非小細(xì)胞肺癌(nsclc)和小細(xì)胞肺癌(sclc)，但還包括腺樣囊性癌、淋巴瘤和肉瘤。非小細(xì)胞肺癌的主要亞型是腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌。這些亞型可能源自不同類型的肺細(xì)胞，它們共同分類為nsclc，因?yàn)樗鼈兊闹委熀皖A(yù)后通常是相似的。如本文中所用，“生物標(biāo)志物”或“標(biāo)志物”可以指其在樣品中的表達(dá)水平或濃度與對(duì)照相比發(fā)生改變的基因、蛋白質(zhì)或mirna。如本文中所用，對(duì)照是指指示與感興趣的結(jié)果相比不同的結(jié)果或與所述不同的結(jié)果相關(guān)的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或濃度。例如，生物標(biāo)志物可以是其表達(dá)水平或濃度與患有疾病(即，肺癌)的受試者的樣品中的對(duì)照相比發(fā)生了改變(例如，升高或降低)的mirna。本領(lǐng)域任何相關(guān)技術(shù)人員應(yīng)理解，與對(duì)照中的表達(dá)水平進(jìn)行比較不一定需要從沒(méi)有肺癌的受試者中獲得樣品并與測(cè)試受試者同時(shí)測(cè)試所述樣品。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)照可以是包括在試劑盒中的對(duì)照樣品或閾值，所述閾值被設(shè)定為代表生物標(biāo)志物的一個(gè)表達(dá)范圍，其中表達(dá)水平落入該范圍將鑒定受試者為患有肺癌或有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。如本文中所用，“生物樣品”或“樣品”旨在包括細(xì)胞、組織或體液的任何取樣，其中可以檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)。此類生物樣品的實(shí)例包括但不限于活組織檢查、涂片、血液、淋巴、尿液、唾液或任何其它身體分泌物或其衍生物。血液可以例如包括全血、血漿、血清或血液的任何衍生物。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是液體生物樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是非細(xì)胞生物流體。在一些實(shí)施方案中，非細(xì)胞體液可以包括血清和/或血漿?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)從受試者獲得樣品。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)生物標(biāo)志物的“表達(dá)水平”或“水平”是指生物標(biāo)志物在生物樣品中的存在/不存在、量或濃度，并且可以以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的任何合適的形式或單位來(lái)表示。例如，核酸(例如dna或rna)的表達(dá)水平可以表示為但不限于拷貝數(shù)(拷貝/ml)、ct(循環(huán)閾值)、cq(定量循環(huán))、ct/cq或log2標(biāo)度表達(dá)水平。此外，表達(dá)水平可以表示為使用任何形式的數(shù)學(xué)模型或算法構(gòu)建的評(píng)分。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“差異表達(dá)”指與對(duì)照或另一樣品相比的對(duì)細(xì)胞組分的測(cè)量，從而確定例如所述細(xì)胞組分的濃度、存在或強(qiáng)度的差異。這種比較的結(jié)果可以以絕對(duì)值給出，即組分存在于樣品中而不存在于對(duì)照中，或者以相對(duì)值給出，即與對(duì)照相比，該組分的表達(dá)或濃度得以增加或降低。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)“增加”和“減少”可以與本公開(kāi)中也使用的術(shù)語(yǔ)“上調(diào)”和“下調(diào)”互換。當(dāng)描述一些實(shí)施方案時(shí)，本公開(kāi)可能已經(jīng)公開(kāi)了作為特定步驟順序的方法。然而，除非另有要求，否則應(yīng)該理解，該方法不應(yīng)限于所公開(kāi)的特定步驟順序。其它步驟順序也是可能的。本文公開(kāi)的步驟的特定順序不應(yīng)該被解釋為不適當(dāng)?shù)南拗?。除非另有要求，否則本文公開(kāi)的方法不應(yīng)限于按書(shū)寫(xiě)的順序執(zhí)行的步驟。步驟的順序可以改變，并且仍然保持在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。如本文中所用，“探針”是指能夠例如通過(guò)與預(yù)期目標(biāo)生物分子直接或間接結(jié)合來(lái)選擇性檢測(cè)該目標(biāo)生物分子的任何分子或試劑。目標(biāo)分子可以是生物標(biāo)志物，例如由生物標(biāo)志物編碼或?qū)?yīng)于生物標(biāo)志物的核苷酸轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)。鑒于本公開(kāi)內(nèi)容，探針可由本領(lǐng)域技術(shù)人員合成，或者衍生自合適的生物制劑。探針可以被特別設(shè)計(jì)成被標(biāo)記的形式?？捎米魈结樀姆肿拥膶?shí)例包括但不限于寡核苷酸、rna、dna(例如，引物)、蛋白質(zhì)、肽、抗體、適體、親和體和有機(jī)分子。在被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)核酸生物標(biāo)志物的探針的情況下，這種探針可以針對(duì)靶區(qū)域、反向鏈上的互補(bǔ)核酸序列或通過(guò)擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生的其拷貝。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“成像測(cè)試”涉及各種用于使受試者身體內(nèi)部可視化以診斷疾病或確定疾病的程度/進(jìn)展的非侵入性方法，并且可以包括計(jì)算機(jī)斷層攝影(ct)(包括低劑量ct掃描，諸如低劑量螺旋ct或低劑量螺旋ct(low?dose?helicalct))、磁共振成像(mri)、正電子發(fā)射斷層攝影(pet)或x射線。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“活組織檢查”涉及例如由病理學(xué)家取出細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行檢查，以確定疾病的存在或程度。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“痰細(xì)胞學(xué)”涉及檢查痰中存在的細(xì)胞以檢測(cè)異常細(xì)胞，諸如肺癌細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“(統(tǒng)計(jì))分類”是指基于包含其類別成員資格已知的觀察(或?qū)嵗?的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，識(shí)別新觀察屬于哪一組類別(子群)的問(wèn)題。一個(gè)實(shí)例是如通過(guò)觀察到的患者特征(性別、血壓、某些癥狀的存在或不存在等)所描述的那樣將診斷分配給給定患者。在機(jī)器學(xué)習(xí)的術(shù)語(yǔ)中，分類被認(rèn)為是監(jiān)督學(xué)習(xí)的實(shí)例，即，在正確識(shí)別的觀察值的訓(xùn)練集可用的情況下的學(xué)習(xí)。相應(yīng)的非監(jiān)督程序被稱為聚類，包括根據(jù)某種內(nèi)在相似性或距離的度量將數(shù)據(jù)分組到類別中。通常，將各個(gè)觀察結(jié)果分析為一組可定量的性質(zhì)，其被不同地稱為解釋性變量或特征。這些屬性可以有不同的分類(例如，對(duì)于血型為“a”、“b”、“ab”或“o”)、序數(shù)(例如，“大”、“中”或“小”)、整數(shù)值(例如，部分詞在電子郵件中出現(xiàn)的次數(shù))或?qū)嵵?例如，血壓的測(cè)量)。其它分類器通過(guò)相似性或距離函數(shù)將觀察與先前觀察進(jìn)行比較來(lái)工作。實(shí)現(xiàn)分類的算法，尤其是在具體實(shí)現(xiàn)中，被稱為分類器。術(shù)語(yǔ)“分類器”有時(shí)也指由分類算法實(shí)現(xiàn)的數(shù)學(xué)函數(shù)，其將輸入數(shù)據(jù)映射到類別。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)訓(xùn)練”或“監(jiān)督(機(jī)器)學(xué)習(xí)”是指從標(biāo)記的訓(xùn)練數(shù)據(jù)推斷函數(shù)的機(jī)器學(xué)習(xí)任務(wù)。訓(xùn)練數(shù)據(jù)可由一組訓(xùn)練實(shí)例組成。在監(jiān)督學(xué)習(xí)中，每個(gè)實(shí)例是由輸入對(duì)象(通常是向量)和期望的輸出值(也稱為監(jiān)督信號(hào))組成的對(duì)。監(jiān)督學(xué)習(xí)算法，即待訓(xùn)練的算法，分析訓(xùn)練數(shù)據(jù)并產(chǎn)生推斷的函數(shù)，該函數(shù)可用于映射新的實(shí)例。一種優(yōu)選方案將允許算法正確地確定未見(jiàn)過(guò)的實(shí)例的類別標(biāo)簽。這需要學(xué)習(xí)算法以“合理”的方式從訓(xùn)練數(shù)據(jù)歸納到未見(jiàn)過(guò)的情況。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“評(píng)分”是指整數(shù)或數(shù)，其可以例如通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算模型(其可以包括但不限于例如svm)來(lái)在數(shù)學(xué)上確定，并且其使用本領(lǐng)域已知的用于統(tǒng)計(jì)分類目的的多個(gè)數(shù)學(xué)方程和/或算法中的任一種來(lái)計(jì)算。這種評(píng)分用于在可能結(jié)果的范圍上枚舉一個(gè)結(jié)果。這種評(píng)分的相關(guān)性和統(tǒng)計(jì)顯著性取決于用于建立結(jié)果譜的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集的大小和質(zhì)量。例如，可將盲樣本輸入到算法中，該算法進(jìn)而基于盲樣本的分析所提供的信息來(lái)計(jì)算評(píng)分。這導(dǎo)致為所述盲樣本生成評(píng)分。基于該評(píng)分，可以做出決定，例如，從其獲得盲樣本的患者有多大可能患有癌癥或不患癌癥?？梢曰谒峁┑臄?shù)據(jù)邏輯地定義范圍的兩端，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的要求任意地定義范圍的兩端。在這兩種情況下，都需要在盲樣本測(cè)試前定義范圍。因此，由這樣的盲樣本生成的評(píng)分，例如數(shù)字“45”，可以基于被定義為從1至50的標(biāo)度的范圍來(lái)指示對(duì)應(yīng)的患者患有癌癥，其中“1”被定義為無(wú)癌癥，“50”被定義為患有癌癥。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了受試者工作特征曲線(“roc曲線”)，其證明了用于檢測(cè)患有肺癌或有肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的mirna測(cè)定的一個(gè)示例性實(shí)施方案的性能。x軸表示測(cè)定的特異性，而y軸表示測(cè)定的靈敏度。圖2顯示了roc曲線，該曲線證明了mirna測(cè)定與cea組合的一個(gè)示例性實(shí)施方案用于檢測(cè)患有肺癌或有肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的性能。x軸表示測(cè)定的特異性，而y軸表示測(cè)定的靈敏度。圖3顯示了表4中提供的用于檢測(cè)患有肺癌或有肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的示例性mirna小組的性能。圖4顯示了cea與表11中提供的示例性mirna小組的組合用于檢測(cè)患有肺癌或有肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的性能。發(fā)明詳述mirna是進(jìn)化上保守的19至25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼rna，其主要功能是介導(dǎo)mrna靶標(biāo)的降解或翻譯抑制。在正常的生理?xiàng)l件下，mirna是廣泛的生物途徑諸如細(xì)胞增殖、分化和凋亡的反饋機(jī)制的關(guān)鍵組分。相反，失調(diào)的mirna涉及癌癥的標(biāo)志，包括通過(guò)抑制生長(zhǎng)抑制來(lái)支持腫瘤生長(zhǎng)，維持增殖信號(hào)傳導(dǎo)和抵抗細(xì)胞死亡，激活侵襲和轉(zhuǎn)移，以及促進(jìn)血管生成。現(xiàn)在已知mirna通過(guò)其腫瘤抑制或致癌活性調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生，越來(lái)越多的證據(jù)表明mirna在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。肺癌的診斷通常通過(guò)痰細(xì)胞學(xué)、活組織檢查或放射成像程序諸如計(jì)算機(jī)斷層攝影(ct)掃描、磁共振成像(mri)掃描或正電子發(fā)射斷層攝影(pet)掃描進(jìn)行。痰細(xì)胞學(xué)快速且便宜，但受累于假陰性率高。放射成像程序的使用既昂貴又使受試者暴露于輻射中，因此不適合用于普通人群的肺癌篩查。蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物(諸如癌胚抗原(cea)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)或細(xì)胞角蛋白19片段抗原(cyfra?21-1))的血液檢測(cè)不能為臨床環(huán)境中的診斷使用提供足夠的準(zhǔn)確性。由于在癌癥中改變的mirna表達(dá)譜反映了疾病的發(fā)展，以及循環(huán)mirna在包括血液、尿液和唾液在內(nèi)的無(wú)數(shù)體液中的穩(wěn)定性和可及性，mirna被認(rèn)為適合作為生物標(biāo)志物。微創(chuàng)方法，諸如基于mirna的液體活組織檢查，可以潛在地克服這些不利方面，并提高整體檢測(cè)準(zhǔn)確性。本發(fā)明涉及確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或測(cè)定獲自受試者的生物樣品中存在的一種或多種生物標(biāo)志物(特別是表1中列出的mirna)的表達(dá)水平。表1：本文所述的mirna生物標(biāo)志物的序列。相對(duì)于對(duì)照，mirna的表達(dá)水平顯示為下調(diào)或上調(diào)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定一種或多種mirna的表達(dá)水平，所述一種或多種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少十一種或至少十二種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-23b-3p和選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-320a-3p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-877-5p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-181c-5p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-487b-3p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-199b-5p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-205-5p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-210-3p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-16-5p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-92a-3p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p和hsa-mir-342-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-342-3p和選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p和hsa-mir-92a-3p中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或至少十一種mirna的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280和hsa-mir-487b-3p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p和hsa-mir-199b-5p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p和hsa-mir-205-5p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p和hsa-mir-16-5p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p和hsa-mir-320a-3p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p和hsa-mir-23b-3p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p和hsa-mir-181c-5p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p和hsa-mir-92a-3p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-210-3p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或測(cè)量和/或測(cè)定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p和hsa-mir-342-3p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測(cè)和/或測(cè)量和/或確定獲自受試者的生物樣品中選自hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-1280、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-92a-3p和hsa-mir-342-3p的一種或多種mirna的表達(dá)水平，以及將這些一種或多種mirna的表達(dá)與其在對(duì)照中的表達(dá)進(jìn)行比較，其中與對(duì)照相比，所述一種或多種mirna的差異表達(dá)水平指示所述受試者患有肺癌或有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照可包括獲自健康受試者、非患病受試者、無(wú)癌癥受試者、無(wú)肺癌受試者和/或未患肺癌或沒(méi)有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的一種或多種生物樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照可包括在獲自所述受試者的一種或多種生物樣品中測(cè)量的用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照樣品可以不與來(lái)自待測(cè)試受試者的生物樣品同時(shí)獲得，并且可以由通過(guò)試劑盒提供的對(duì)照樣品代表，或者在一些方面，由在早期臨床研究中確定的對(duì)照人群中mirna表達(dá)的閾值代表。在一些實(shí)施方案中，hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p和/或hsa-mir-92a-3p中的一種或多種在生物樣品中的表達(dá)水平與對(duì)照中的所述表達(dá)水平相比被上調(diào)。在一些實(shí)施方案中，生物樣品中的hsa-mir-1280和/或hsa-mir-342-3p的表達(dá)水平與對(duì)照的所述表達(dá)水平相比被下調(diào)。在一些實(shí)施方案中，患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者中hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-16-5p和/或hsa-mir-92a-3p中的一種或多種的差異表達(dá)水平在生物樣品中與對(duì)照的所述表達(dá)水平相比被上調(diào)。在一些實(shí)施方案中，患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者中hsa-mir-1280和/或hsa-mir-342-3p的差異表達(dá)水平在生物樣品中與對(duì)照的所述表達(dá)水平相比被下調(diào)。在某些實(shí)施方案中，用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括：a.將獲自受試者的生物樣品與適合于檢測(cè)一種或多種mirna的分離的探針組接觸，所述一種或多種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p；b.將生物樣品中所述一種或多種mirna的表達(dá)水平與對(duì)照中所述mirna的水平進(jìn)行比較；c.通過(guò)所述一種或多種mirna與對(duì)照相比的差異表達(dá)來(lái)確定所述受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括非細(xì)胞生物流體。在一些其它實(shí)施方案中，所述非細(xì)胞生物流體可以是血漿或血清。在某些實(shí)施方案中，用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法還包括檢測(cè)至少一種附加的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一些實(shí)例中，所述附加的生物標(biāo)志物可包括但不限于癌胚抗原(cea)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)、癌抗原125(ca-125)、細(xì)胞角蛋白19片段抗原(cyfra?21-1)等。在某些實(shí)施方案中，用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法還包括一種或多種測(cè)試，例如但不限于成像測(cè)試、痰細(xì)胞學(xué)、活組織檢查或其組合。在某些實(shí)施方案中，可以使用痰細(xì)胞學(xué)、活組織檢查、細(xì)針抽吸或診斷成像測(cè)試來(lái)進(jìn)一步測(cè)試被確定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者，所述診斷成像測(cè)試包括但不限于x射線、計(jì)算機(jī)斷層攝影(ct)掃描、低劑量ct掃描、磁共振成像(mri)掃描或正電子發(fā)射斷層攝影(pet)掃描。肺癌篩查的方法是本領(lǐng)域已知的，包括肺癌篩查腫瘤學(xué)的nccn臨床實(shí)踐指南的最新版本，通過(guò)引用以其整體并入本文。還提供了使用本文公開(kāi)的方法治療被確定患有肺癌的受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法還可包括對(duì)被確定患有肺癌的受試者施用治療的步驟。這樣的受試者將被推薦給醫(yī)療從業(yè)者，并且在確定合適的情況下，用合適的治療方法(諸如，但不限于抗癌化合物、手術(shù)、免疫療法或放射療法或這些方法的組合)進(jìn)行治療。當(dāng)受試者被診斷患有肺癌時(shí)，治療選擇可包括手術(shù)、放射療法(包括但不限于外部放射療法、調(diào)強(qiáng)放射療法、質(zhì)子療法、立體定向放射手術(shù)或近距離放射療法)，或者施用一種或多種抗癌化合物，所述抗癌化合物可包括但不限于化學(xué)療法(包括但不限于順鉑、卡鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、長(zhǎng)春瑞濱、依托泊苷或培美曲塞，無(wú)論是單獨(dú)地還是組合地)、靶向療法(諸如針對(duì)特定方面如血管生成、egfr、kras、alk、ntrk、braf、ros1等的藥物或單克隆抗體，可包括但不限于奧希替尼、厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼、達(dá)克替尼、克唑替尼、塞瑞替尼、達(dá)拉菲尼、曲美替尼、貝伐珠單抗、貝伐珠單抗、埃萬(wàn)妥單抗、西妥昔單抗)、免疫療法(例如，pd-1和pdl-1抑制劑如帕博利珠單抗或納武單抗)或細(xì)胞療法(包括嵌合抗原受體t細(xì)胞)。用于治療肺癌的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括最新版本的非小細(xì)胞肺癌腫瘤學(xué)nccn臨床實(shí)踐指南和小細(xì)胞肺癌腫瘤學(xué)nccn臨床實(shí)踐指南，通過(guò)引用以其整體并入本文。在某些實(shí)施方案中，用于治療患有肺癌的受試者的方法包括：a.將獲自受試者的生物樣品與適合于檢測(cè)一種或多種mirna的分離的探針組接觸，所述一種或多種mirna選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p；b.將生物樣品中所述一種或多種mirna的表達(dá)水平與對(duì)照中所述mirna的水平進(jìn)行比較；c.通過(guò)所述一種或多種mirna與對(duì)照相比的差異表達(dá)來(lái)確定所述受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)；d.用選自施用抗癌化合物、手術(shù)和/或放射療法的一種或多種療法治療被確定患有肺癌或被確定有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者。在某些實(shí)施方案中，用于治療患有肺癌的受試者的方法還包括測(cè)量受試者中至少一種附加的生物標(biāo)志物的水平。在某些實(shí)施方案中，所述附加的生物標(biāo)志物是選自癌胚抗原(cea)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)、癌抗原125(ca-125)和細(xì)胞角蛋白19片段抗原(cyfra?21-1)中的一種或多種。在一些實(shí)例中，附加的生物標(biāo)志物是癌胚抗原(cea)。在某些實(shí)施方案中，該方法還包括成像測(cè)試、痰細(xì)胞學(xué)或活組織檢查。本文還提供了用于本文公開(kāi)的方法的組合物/劑/試劑。在一些實(shí)施方案中，此類組合物/劑/試劑可包括但不限于探針、抗體、親和體、核酸和/或適體。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可以檢測(cè)(或檢測(cè))來(lái)自生物樣品的一小組生物標(biāo)志物的表達(dá)水平(例如，mirna)。任何組合物都可以以試劑盒或試劑混合物的形式提供。舉例來(lái)說(shuō)，可以在試劑盒中提供標(biāo)記探針，用于檢測(cè)一小組生物標(biāo)志物。試劑盒可包括用于測(cè)定的所有必需或足夠的組分，其可包括但不限于靶富集試劑、檢測(cè)試劑(例如，探針和/或熒光染料)、緩沖液、對(duì)照試劑(例如，陽(yáng)性和陰性對(duì)照)、擴(kuò)增試劑、固體支持物、標(biāo)簽、說(shuō)明書(shū)、校準(zhǔn)品和參考材料等。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括一組用于一小組生物標(biāo)志物的探針和固定該組探針的固體支持物。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括一組用于一小組生物標(biāo)志物的探針、固體支持物和用于處理待測(cè)樣品的試劑(例如，用于從樣品中分離蛋白質(zhì)或核酸的試劑)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括適用于檢測(cè)一小組生物標(biāo)志物的檢測(cè)試劑在制備或制備用于(或當(dāng)使用時(shí))確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的用途。在某些實(shí)施方案中，適用于試劑盒的檢測(cè)試劑(例如，探針)包括但不限于寡核苷酸、rna、dna(例如，引物)、蛋白質(zhì)、肽、抗體、適體、親和體和有機(jī)分子。在被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)核酸生物標(biāo)志物的探針的情況下，這種探針可以指向靶區(qū)域、反向鏈上的互補(bǔ)核酸序列或通過(guò)擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生的其拷貝。在一些實(shí)施方案中，本文提供了直接或間接檢測(cè)本文所述生物標(biāo)志物的基于dna、rna和蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。本發(fā)明還提供了用于此類診斷目的的組合物、試劑和試劑盒。本文描述的診斷方法可以是定性的或定量的?？梢允褂枚吭\斷方法，例如，將檢測(cè)到的生物標(biāo)志物水平與截?cái)嗷蜷撝邓竭M(jìn)行比較。在適用的情況下，定性或定量診斷方法還可包括靶標(biāo)、信號(hào)或中間體的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，在核酸(例如，dna或rna)水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物。例如，測(cè)定樣品中存在的生物標(biāo)志物rna(例如，mirna)的量(例如，以測(cè)定生物標(biāo)志物表達(dá)的水平)。生物標(biāo)志物核酸(例如，mirna、擴(kuò)增的cdna等)可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種核酸技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)/定量，所述技術(shù)包括但不限于測(cè)序、核酸雜交(例如northern印跡)、微陣列和核酸擴(kuò)增(例如，定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qpcr)、鎖核酸(lna)實(shí)時(shí)pcr、基于crispr的測(cè)定或等溫?cái)U(kuò)增分析。等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定可包括，例如，但不限于，切刻核酸內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng)(near)測(cè)定、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)測(cè)定、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(lamp)測(cè)定、螺旋酶依賴性擴(kuò)增(hda)測(cè)定、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)測(cè)定或鏈置換擴(kuò)增(sda)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)mirna生物標(biāo)志物的方法可包括使用wo2011159256a1中公開(kāi)的測(cè)定方法，并且用于檢測(cè)mirna的試劑盒可包括基于wo2011159256a1的教導(dǎo)設(shè)計(jì)的莖環(huán)寡核苷酸，所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。本文還提供了用于確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括能夠檢測(cè)一種或多種mirna生物標(biāo)志物的分離的探針組，所述一種或多種mirna生物標(biāo)志物選自hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括能夠檢測(cè)hsa-mir-1280、hsa-mir-487b-3p、hsa-mir-199b-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-mir-320a-3p、hsa-mir-23b-3p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-210-3p、hsa-mir-342-3p和hsa-mir-877-5p的分離的探針組。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于檢測(cè)獲自受試者的生物樣品中的至少一種附加的生物標(biāo)志物的試劑。在某些實(shí)施方案中，所述附加的生物標(biāo)志物是癌胚抗原(cea)。可以在缺少本文中具體公開(kāi)的任何一個(gè)或多個(gè)元件、一個(gè)或多個(gè)限制的情況下適當(dāng)?shù)貙?shí)施本文說(shuō)明性描述的本發(fā)明。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“含有”等應(yīng)被廣義地理解而不是限制。此外，本文中采用的術(shù)語(yǔ)和表述被用作描述性的而不是限制性的術(shù)語(yǔ)，并且在使用此類術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)，不意圖排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)，各種修改是可能的。因此，應(yīng)該理解的是，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選的特征進(jìn)行了具體公開(kāi)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開(kāi)的本文中具體實(shí)施的發(fā)明的修改和變化，并且此類修改和變化被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明已經(jīng)在本文中被廣泛和一般地描述。落入一般公開(kāi)內(nèi)容內(nèi)的每個(gè)較窄的種類和亞類分組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括對(duì)本發(fā)明的一般性描述，附帶條件或負(fù)面限制是從該類中除去任何主題，而不管所去除的材料是否在本文中具體敘述。貫穿本公開(kāi)，某些實(shí)施方案可以以范圍的形式公開(kāi)。應(yīng)該理解的是，范圍格式的描述僅僅是為了方便和簡(jiǎn)潔，不應(yīng)該被解釋為對(duì)所公開(kāi)的范圍的不可改變的限制。因此，范圍的描述應(yīng)該被認(rèn)為已經(jīng)具體公開(kāi)了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如，諸如從1至6的范圍的描述應(yīng)該被認(rèn)為已經(jīng)具體公開(kāi)了子范圍，諸如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)字，例如1、2、3、4、5和6。無(wú)論范圍寬窄，這一原則均適用。其它實(shí)施方案在下面的權(quán)利要求和非限制性實(shí)例中。此外，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫(kù)什組的形式描述的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也因此以馬庫(kù)什組的任何單獨(dú)成員或成員的亞組的形式描述。在以下實(shí)例中提供了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。盡管足夠詳細(xì)地描述了示例性實(shí)施方案，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于這些實(shí)例。肺癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)評(píng)分或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的樣本計(jì)算在本領(lǐng)域中已知，可以組合生物標(biāo)志物(例如，mirna)以形成生物標(biāo)志物小組來(lái)例如使用線性模型計(jì)算疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。一個(gè)實(shí)例是使用邏輯回歸(一種形式的線性模型)來(lái)計(jì)算這種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。還可以使用從包括支持向量機(jī)(svm)算法、邏輯回歸算法、多項(xiàng)式邏輯回歸算法、費(fèi)歇爾線性判別算法、二次分類器算法、感知器算法、k-最近鄰算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法、隨機(jī)森林算法、決策樹(shù)算法、樸素貝葉斯算法、自適應(yīng)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)算法和結(jié)合多種學(xué)習(xí)算法的集成學(xué)習(xí)方法的組中選擇的分類算法來(lái)計(jì)算預(yù)測(cè)評(píng)分。本領(lǐng)域的挑戰(zhàn)涉及鑒定可用于鑒定有患疾病(諸如肺癌)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的相關(guān)生物標(biāo)志物，諸如循環(huán)mirna，其。當(dāng)相關(guān)的mirna可以通過(guò)詳盡的和精心設(shè)計(jì)的研究來(lái)鑒定時(shí)，將相關(guān)mirna的測(cè)量水平應(yīng)用于此類統(tǒng)計(jì)模型中以生成用于預(yù)測(cè)受試者患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)分，將在了解現(xiàn)有技術(shù)水平的人的技能范圍內(nèi)。用于執(zhí)行本文公開(kāi)的計(jì)算(例如，預(yù)測(cè)評(píng)分的計(jì)算)的此類數(shù)學(xué)方法的實(shí)例可以是但不限于支持向量機(jī)算法、邏輯回歸算法、多項(xiàng)式邏輯回歸算法、費(fèi)歇爾線性判別算法、二次分類器算法、感知器算法、k-最近鄰算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法、隨機(jī)森林算法、決策樹(shù)算法、樸素貝葉斯算法、自適應(yīng)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)算法以及結(jié)合多種學(xué)習(xí)算法的集成學(xué)習(xí)方法。在一個(gè)實(shí)例中，使用線性模型和支持向量機(jī)算法來(lái)計(jì)算預(yù)測(cè)評(píng)分。作為說(shuō)明性的實(shí)例，對(duì)照和患有肺癌的受試者具有不同的計(jì)算的疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。對(duì)照和患有肺癌的受試者的疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的擬合概率分布顯示可以發(fā)現(xiàn)兩組之間的分離?；谠撓闰?yàn)概率和先前確定的擬合概率分布，可以基于未知受試者的疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分來(lái)計(jì)算他們患肺癌的概率(風(fēng)險(xiǎn))。分?jǐn)?shù)越高，受試者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)越高。此外，疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以例如告知未知受試者患肺癌的概率(風(fēng)險(xiǎn))與例如高危人群中肺癌率相比的倍數(shù)變化。此類方法取得成功的要求是有高質(zhì)量的數(shù)據(jù)可供利用。在大量明確定義的臨床樣品(包括來(lái)自癥狀性非肺癌患者的適當(dāng)對(duì)照(疾病對(duì)照))中所有檢測(cè)到的mirna的定量數(shù)據(jù)，不僅提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性以及精確度，而且確保了用于使用例如定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qpcr)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用的鑒定的生物標(biāo)志物小組的一致性。作為實(shí)例，下面的公式1舉例說(shuō)明了用于肺癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的線性模型的使用，其中疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(對(duì)于每個(gè)受試者是唯一的)指示受試者患有肺癌的可能性。這通過(guò)對(duì)例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19種mirna的加權(quán)測(cè)量值求和來(lái)計(jì)算。公式1-其中l(wèi)og2copy_mirnai是n種單獨(dú)的mirna的測(cè)試樣品體積中對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的拷貝數(shù)(例如，對(duì)于12種mirna的實(shí)例，n＝12)。由此，ki-用于加權(quán)多種mirna靶標(biāo)的系數(shù)和c-常數(shù)，可以通過(guò)線性模型的應(yīng)用來(lái)導(dǎo)出。疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分低于0的受試者將被視為0，疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高于100的受試者將被視為100。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在了解相關(guān)mirna生物標(biāo)志物的身份后，可以得到相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和截?cái)嘀狄澡b定有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者。這種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算算法的另一個(gè)實(shí)例包括使用邏輯回歸模型：公式2-其中，n是單獨(dú)的mirna的數(shù)目(例如，對(duì)于12個(gè)mirna的實(shí)例，n＝12)，ki-用于加權(quán)多個(gè)mirna靶標(biāo)的系數(shù)，ct-循環(huán)閾值(通常定義為熒光信號(hào)越過(guò)閾值所需的實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)中的循環(huán)次數(shù))，并且常數(shù)可以通過(guò)應(yīng)用線性模型獲得。這種算法的又一個(gè)實(shí)例還結(jié)合了使用具有已知水平的經(jīng)測(cè)定的mirna的參考樣品，以歸一化每次測(cè)定運(yùn)行的評(píng)分，以說(shuō)明運(yùn)行之間的變化(其可被稱為定量參考(qr))，并且在一些實(shí)施方案中，qr評(píng)分的平均值可用于計(jì)算預(yù)期的qr評(píng)分。使用上面提供的實(shí)例，下面提供可如何進(jìn)行這種歸一化的實(shí)例。在本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解范圍內(nèi)，知道相關(guān)mirna生物標(biāo)志物的身份，推導(dǎo)出相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、qr得評(píng)和截?cái)嘀?，以鑒定有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者。公式3-其中，n是單獨(dú)的mirna的數(shù)目(例如，對(duì)于12個(gè)mirna的實(shí)例，n＝12)，ki-用于加權(quán)多個(gè)mirna靶標(biāo)的系數(shù)，ct-循環(huán)閾值(通常定義為實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)中熒光信號(hào)越過(guò)閾值所需的循環(huán)次數(shù)，有時(shí)也稱為cq)，常數(shù)可以通過(guò)應(yīng)用線性模型獲得，qr運(yùn)行-從特定運(yùn)行獲得的qr評(píng)分，qr預(yù)期是從多次驗(yàn)證運(yùn)行獲得的qr評(píng)分的平均值。在一些實(shí)施方案中，基于從靶mirna的ct得出的結(jié)果，該測(cè)試可用于將患者分層為低風(fēng)險(xiǎn)或高風(fēng)險(xiǎn)類別。低風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果表明患者患有或發(fā)展肺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低。高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果表明存在與肺癌高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的mirna，并且這些患者有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)該根據(jù)臨床指南考慮進(jìn)行進(jìn)一步的診斷檢查。實(shí)施例方法和材料采用逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)與肺癌組和非肺癌組相關(guān)的多種mirna生物標(biāo)志物。該測(cè)定包括五個(gè)步驟：步驟1：從貧血小板的血漿樣品中分離rna步驟2：cdna合成步驟3：預(yù)擴(kuò)增步驟4：通過(guò)定量pcr(qpcr)檢測(cè)mirna步驟5：將mirna?ct(閾值循環(huán))值(也稱為cq或定量循環(huán))轉(zhuǎn)換為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分使用半自動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行rna的提取。通過(guò)向貧血小板的血漿(platelet-poorplasma,ppp)中手動(dòng)加入裂解緩沖液c和蛋白酶k，然后在37℃孵育15分鐘，進(jìn)行預(yù)處理。將預(yù)處理過(guò)的樣品加入提取柱體中，然后將其裝載到csc?48、csc16、rsc?48或rsc?16儀器上。提取的自動(dòng)化部分在使用順磁性顆粒的儀器中進(jìn)行，所述儀器提供流動(dòng)固相以優(yōu)化樣品捕獲、洗滌和核酸純化。在cdna合成步驟中，在單個(gè)反應(yīng)中使用mirna特異性的基于莖環(huán)的逆轉(zhuǎn)錄引物將來(lái)自每個(gè)樣品的mirna靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為cdna。與線性引物相比，莖環(huán)結(jié)構(gòu)改善了引物與靶mirna的雜交，這導(dǎo)致了更高的分析靈敏度。其還使引物與mirna的前體形式的雜交降至最少，從而提高了測(cè)定分析的特異性。在預(yù)擴(kuò)增步驟中，在單個(gè)反應(yīng)中使用序列特異性pcr引物對(duì)擴(kuò)增cdna。預(yù)擴(kuò)增增加了qpcr步驟之前mirna靶標(biāo)的拷貝數(shù)，同時(shí)保持了靶標(biāo)擴(kuò)增特異性。在qpcr步驟中，通過(guò)序列特異性正向pcr引物和半巢式序列特異性反向pcr引物擴(kuò)增每個(gè)mirna靶標(biāo)。這種組合使得能夠增強(qiáng)對(duì)廣泛的高度同源家族成員的區(qū)分。然后在加速循環(huán)條件下，在單重反應(yīng)中使用sybr?green?i染料檢測(cè)擴(kuò)增子。用于肺癌診斷的mirna生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證研究設(shè)計(jì)本研究的主要目的是鑒定和開(kāi)發(fā)在血漿和/或血清樣品中鑒定的循環(huán)生物標(biāo)志物特征，以鑒定有肺癌風(fēng)險(xiǎn)或患有肺癌的受試者。收集了623名受試者的血液樣品，其中525名最終用于開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證。排除樣品的原因包括缺乏臨床信息、不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或樣品中出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。表2中詳細(xì)描述了招募的受試者隊(duì)列的詳細(xì)情況。表2：用于肺癌生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的研究隊(duì)列的患者人口統(tǒng)計(jì)。n＝患者人數(shù)；sd＝標(biāo)準(zhǔn)偏差；％＝百分比。mirna生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證總共525個(gè)臨床樣品用于mirna分類器的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，包括261個(gè)肺癌(lc)樣品和264個(gè)非lc樣品。使用3批制造的試劑盒在3個(gè)不同地點(diǎn)進(jìn)行了57次測(cè)試。所有樣品均按隨機(jī)順序運(yùn)行，并且對(duì)操作者盲化。收集運(yùn)行數(shù)據(jù)并將其作歸一化，并且在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算中使用邏輯回歸模型(其示例性方法在說(shuō)明書(shū)中提供)來(lái)對(duì)lc和非lc患者進(jìn)行分類。表3詳細(xì)描述了單獨(dú)使用或與其它mirna生物標(biāo)志物組合使用時(shí)mirna生物標(biāo)志物的性能，表4-8提供了(并在圖1中以圖形方式描繪了)此類mirna生物標(biāo)志物的示例性實(shí)施方案?？梢钥闯觯M合5種或更多種mirna生物標(biāo)志物時(shí)，小組的性能通常達(dá)到峰值，添加額外的mirna生物標(biāo)志物不會(huì)進(jìn)一步顯著改變auc。此外，表9中列出了所選3-mirna組合的示例性小組。僅單獨(dú)使用mirna生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)了80.5％的總曲線下面積(auc)、75.5％的靈敏度和70.1％的特異性的性能(圖2)。將癌胚抗原(cea)的水平進(jìn)一步與前一步獲得的mirna分類器組合。表10詳細(xì)描述了cea與mirna生物標(biāo)志物(單個(gè)或與其它mirna生物標(biāo)志物的組合)組合時(shí)的性能，其中表11中提供了(并在圖3中以圖形方式描繪)這種mirna生物標(biāo)志物的示例性實(shí)施方案。mirna與cea的組合提高了測(cè)試的性能，因此除了測(cè)量受試者中mirna生物標(biāo)志物的水平以外，測(cè)試cea的水平可以是有價(jià)值的。邏輯回歸模型用于計(jì)算基于mirna和cea水平的新風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。組合mirna與cea的新模型實(shí)現(xiàn)了86.4％的auc、84.3％的靈敏度和71.6％的特異性(圖4)。為了避免疑問(wèn)，本發(fā)明的mirna的組合不限于表4-9和表11中列出的示例性小組?？蓮?2種mirna中選擇任何合適的組合或數(shù)量的mirna，以形成給出期望的或足夠高的auc的小組。表3：mirna生物標(biāo)志物單獨(dú)地或以至多12種mirna的組合用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的平均和最高auc值。表4：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的mirna生物標(biāo)志物的示例性小組(具有hsa-mir-1280)。表5：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的mirna生物標(biāo)志物示例性小組(具有hsa-mir-199b-5p)。表6：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的mirna生物標(biāo)志物(hsa-mir-181c-5p)的示例性小組。表7：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的mirna生物標(biāo)志物的示例性小組(具有hsa-mir-210-3p)。表8：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的mirna生物標(biāo)志物的示例性小組(具有hsa-mir-16-5p)。表9：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的所選3種mirna組合的示例性小組。表10：使用mirna生物標(biāo)志物與cea的組合(在至多12種mirna的小組中)以鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的平均和最高auc值。 生物標(biāo)志物的數(shù)目 平均auc 方差 cea+1mirna 0.52 0.0082 cea+2mirna 0.76 0.0027 cea+3mirna 0.78 0.0024 cea+4mirna 0.79 0.0024 cea+5mirna 0.80 0.0021 cea+6mirna 0.81 0.0021 cea+7mirna 0.81 0.0022 cea+8mirna 0.80 0.0022 cea+9mirna 0.80 0.0024 cea+10mirna 0.80 0.0025 cea+11mirna 0.80 0.0025 cea+12mirna 0.80 0.0026 表11：用于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的目的的cea與mirna生物標(biāo)志物的示例性小組。討論存在對(duì)用于肺癌早期檢測(cè)的非侵入性方法的未滿足的臨床需求。本文提供了適于鑒定患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的循環(huán)生物標(biāo)志物。鑒定了無(wú)論單獨(dú)地還是組合地用作生物標(biāo)志物表達(dá)特征都適合用于區(qū)分患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者與無(wú)肺癌對(duì)照的循環(huán)生物標(biāo)志物。循環(huán)生物標(biāo)志物的使用提高了該小組可能提供用于早期檢測(cè)疾患的工具的可能性，因?yàn)榇祟悳y(cè)試將更容易地用于一般測(cè)試用途并且是最小侵入性的。本文鑒定的生物標(biāo)志物物也顯示出與其它癌癥生物標(biāo)志物物諸如癌胚抗原(cea)組合是有用的。本研究涉及在3個(gè)不同的地點(diǎn)進(jìn)行生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，以說(shuō)明不同地點(diǎn)的可變性，并使用3個(gè)不同批次的試劑盒說(shuō)明制造差異。在以隨機(jī)順序進(jìn)行測(cè)試時(shí)，操作者不知道樣品的類型，潛在的偏差被進(jìn)一步減少，以確保生物標(biāo)志物小組在確定受試者是否患有肺癌或是否有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的穩(wěn)健性和可靠性。本文提供的實(shí)例涉及本發(fā)明預(yù)期用途的示例性實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物旨在用作受試者的肺癌診斷的輔助手段，有時(shí)結(jié)合其它臨床因素或癥狀。因此，生物標(biāo)志物旨在區(qū)分患有肺癌或有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者與未患肺癌的受試者。采用此類生物標(biāo)志物的測(cè)試的可能實(shí)施方案可以是用于研究用途的試劑、實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的測(cè)試或用于使用本文公開(kāi)的生物標(biāo)志物組進(jìn)行肺癌的早期檢測(cè)或輔助診斷的體外檢測(cè)試劑盒。在其它情況下，被分類為有肺癌風(fēng)險(xiǎn)或患有肺癌的患者可用一種或多種適用于治療該疾病的治療劑或療法來(lái)治療?？梢灶A(yù)見(jiàn)的是，這種測(cè)試可以單獨(dú)使用，或者與其它方法結(jié)合使用，所述其它方法包括痰細(xì)胞學(xué)、活組織檢查或成像測(cè)試(其包括ct掃描、mri、x射線或pet掃描)、癌癥生物標(biāo)志物物(例如cea)的測(cè)試或由醫(yī)療從業(yè)者或本領(lǐng)域類似技術(shù)人員認(rèn)可的用于診斷肺癌的任何其它方法。參考文獻(xiàn)1.ferlay?j,ervik?m,lam?f,colombet?m,mery?l,?m,znaor?a,soerjomataram?i,bray?f(2020).global?cancer?observatory:cancer?today.lyon,france:international?agency?for?research?on?cancer.可從https://gco.iarc.fr/today,accessed?12dec2022獲得。2.too?hp?and?azlinda?ba.modified?stem-loop?oligonucleotide?mediatedreverse?transcription?and?base-spacing?constrained?quantitative?pcr.2011dec22.(wo2011159256a1).3.nccn?clinical?practice?guidelines?in?oncology?for?non-small?celllung?cancer?version?6.2022national?comprehensive?cancer?network,inc.2022。保留所有權(quán)利。訪問(wèn)時(shí)間是2022年12月12日。要查看指南的最新和完整版本，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)nccn.org網(wǎng)站。4.nccn?clinical?practice?guidelines?in?oncology?for?small?cell?lungcancer?version?2.2023national?comprehensive?cancer?network,inc.2022。保留所有權(quán)利。訪問(wèn)時(shí)間是2022年12月12日。要查看指南的最新和完整版本，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)nccn.org網(wǎng)站。5.nccn?clinical?practice?guidelines?in?oncology?for?lung?cancerscreening?version?1.2023national?comprehensive?cancer?network,inc.2022。保留所有權(quán)利。訪問(wèn)時(shí)間是2022年12月12日。要查看指南的最新和完整版本，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)nccn.org網(wǎng)站。

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