本公開涉及具有丙醛脫氫酶活性的變體多肽；編碼所述變體多肽的多核苷酸；包含所述變體多肽、編碼所述變體多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的載體的微生物；以及用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物。
背景技術(shù)：
1、丙烯酸(aa)是一種分子內(nèi)具有雙鍵和官能團(tuán)的高反應(yīng)性物質(zhì)，其被用作通過各種化學(xué)反應(yīng)生產(chǎn)聚合物的單體，因此被生產(chǎn)用于各種目的，例如亞克力(acrylics)、纖維、涂料等。特別是，高純度的冰丙烯酸(glacialaa)主要用于生產(chǎn)超吸收性聚合物(sap)，并在尿片和衛(wèi)生產(chǎn)品中作為吸濕劑商業(yè)化。目前，大多數(shù)aa是通過基于石油化工的丙烯的氧化反應(yīng)來生產(chǎn)的，但是由于最近的環(huán)境和溫度問題以及消費(fèi)者對(duì)生物友好化學(xué)產(chǎn)品需求的增加，通過基于生物的路線而不是基于石油的路線生產(chǎn)丙烯酸的需求正在增加。
2、在這方面，已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試，通過基因操作和微生物發(fā)酵來生產(chǎn)aa的前體3-羥基丙酸(3hp)。例如，實(shí)例可包括通過從乳酸(la)或3hp的轉(zhuǎn)化反應(yīng)生產(chǎn)aa的方法，或通過熱分解將聚-3-羥基丙酸(p3hp)轉(zhuǎn)化為aa的方法等。在后一種情況下，其優(yōu)點(diǎn)是aa作為固態(tài)前體產(chǎn)生，不像3hp通過從溶解狀態(tài)純化以液態(tài)產(chǎn)生。
3、同時(shí)，可以使用甘油(其是生物柴油的副產(chǎn)物)作為碳源，通過3hp-coa依賴性途徑和3hp-coa非依賴性途徑的酶促反應(yīng)來生物生產(chǎn)3hp。3hp是一種有用的中間體，其可以轉(zhuǎn)化成各種物質(zhì)，例如丙烯酸、丙烯腈、甲基丙烯酸、1,3-丙二醇等。
4、如圖1所示，3hp-coa依賴性途徑是一種酶促反應(yīng)，通過該反應(yīng)，3-羥基丙醛(3-hpa)被pdup酶轉(zhuǎn)化為3hp-coa。產(chǎn)生的3hp-coa隨后可以轉(zhuǎn)化為aa、3hp或p3hp等。
5、以前的文獻(xiàn)(bioresource?technology，第103卷，第1期，2012年1月，第1-6頁)報(bào)道了關(guān)于使用pdup生產(chǎn)3hp的研究。然而，大多數(shù)先前的研究僅公開了來源于鼠傷寒沙門氏菌(salmonella?typhimurium)lt2或羅伊乳酸桿菌(lactobacillus?reuteri)的野生型pdup(bioresour?technol.2013mar；131:548-51.；kr?10-2016-0006030a)，并且沒有公開關(guān)于pdup突變體及其用途的研究。
6、因此，仍然需要增加有效的3hp-coa或其衍生物的生產(chǎn)能力的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、[技術(shù)問題]
2、本公開要解決的技術(shù)問題是提供具有新型丙醛脫氫酶活性的變體多肽；編碼所述變體多肽的多核苷酸；包含所述變體多肽、編碼所述變體多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的載體的微生物；以及用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物。
3、[技術(shù)方案]
4、本公開的一個(gè)目的是提供具有丙醛脫氫酶活性的變體多肽，其中對(duì)應(yīng)于seq?idno:1的第272位的氨基酸被另一種氨基酸取代。
5、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體多肽可以是其中對(duì)應(yīng)于seq?id?no:1的第272位的氨基酸被選自由以下組成的組中的任何一種氨基酸取代的多肽：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
6、在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體多肽可以包括選自由seq?id?no:3至7和seq?idno:33至46組成的組的氨基酸序列。
7、本公開的另一個(gè)目的是提供編碼所述變體多肽的多核苷酸。
8、本公開的另一方面是提供一種微生物，其包含所述變體多肽、編碼所述變體多肽的多核苷酸和含有所述多核苷酸的載體中的任意一種或多種。
9、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物與包含seq?id?no:1的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的微生物相比，具有增加的3hp-coa或其衍生物的生產(chǎn)能力。
10、作為根據(jù)前述任一實(shí)施方案的微生物，所述微生物可以是埃希氏菌屬的微生物。
11、作為根據(jù)前述任一實(shí)施方案的微生物，所述埃希氏菌屬的微生物可以是大腸桿菌。
12、本公開的又一個(gè)目的是提供一種用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物。
13、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括從培養(yǎng)的微生物、微生物的培養(yǎng)產(chǎn)物、微生物的發(fā)酵產(chǎn)物或培養(yǎng)基中回收目標(biāo)物質(zhì)的步驟。
14、本公開的又一個(gè)目的是提供用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的組合物，所述組合物包含變體多肽、微生物或其組合。
15、本公開的又一個(gè)目的是提供微生物用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的用途。
16、[有利效果]
17、當(dāng)培養(yǎng)包含本公開的具有丙醛脫氫酶活性的變體多肽的微生物時(shí)，與現(xiàn)有的未修飾的微生物相比，可以以更高的產(chǎn)量生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物。
1.一種具有丙醛脫氫酶活性的變體多肽，其中對(duì)應(yīng)于seq?id?no:1的第272位的氨基酸被另一種氨基酸取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體多肽，其中對(duì)應(yīng)于seq?id?no:1的第272位的氨基酸被選自由以下組成的組中的任何一種氨基酸取代：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體多肽，其中所述變體多肽包含選自由seq?id?no:3至7和seq?id?no:33至46組成的組的氨基酸序列。
4.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的變體多肽。
5.一種微生物，其包含權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的變體多肽、編碼所述變體多肽的多核苷酸和包含所述多核苷酸的載體中的任意一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物，其中所述微生物與包含seq?id?no:1的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸的微生物相比，具有增加的3hp-coa或其衍生物的生產(chǎn)能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物，其是埃希氏菌屬的微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物，其中所述埃希氏菌屬的微生物是大腸桿菌。
9.一種生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括從培養(yǎng)的微生物、所述微生物的培養(yǎng)產(chǎn)物、所述微生物的發(fā)酵產(chǎn)物或培養(yǎng)基中回收目標(biāo)物質(zhì)的步驟。
11.一種用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的組合物，其包含權(quán)利要求1所述的變體多肽；包含所述變體多肽、編碼所述變體多肽的多核苷酸和含有所述多核苷酸的載體中的任意一種或多種的微生物；或它們的組合。
12.權(quán)利要求1所述的變體多肽，或包含所述變體多肽、編碼所述變體多肽的多核苷酸和含有所述多核苷酸的載體中的任意一種或多種的微生物用于生產(chǎn)3hp-coa或其衍生物的用途。